Procedimentos de edição de genoma otimizados

A edição do genoma significa a alteração deliberada do DNA com métodos genéticos moleculares. É usado para criar plantas e animais, mas também em pesquisas médicas e biológicas básicas. Os procedimentos mais comuns incluem a “tesoura de genes” CRISPR/Cas9 e suas variantes conhecidas como editores de base. Em ambos os casos, as enzimas devem ser transportadas para o núcleo da célula-alvo. Na chegada, o sistema CRISPR/Cas9 corta o DNA em locais específicos, o que causa uma quebra na fita dupla. Novos segmentos de DNA podem então ser inseridos naquele local. Os editores de base usam um mecanismo molecular semelhante, mas não cortam a fita dupla do DNA. Em vez disso, uma enzima acoplada à proteína Cas9 realiza uma troca direcionada de nucleotídeos – os blocos básicos de construção do genoma. Em três estudos sucessivos, a equipe do Prof. Wittbrodt conseguiu aumentar consideravelmente a eficiência e a aplicabilidade desses métodos.

Um desafio ao usar CRISPR/Cas9 consiste na entrega eficiente das enzimas Cas9 necessárias ao núcleo. “A célula tem um elaborado mecanismo ‘bouncer’. Ele distingue entre proteínas que podem se translocar para o núcleo e aquelas que deveriam permanecer no citoplasma”, explica a Dra. Tinatini Tavhelidse-Suck, da equipe do Prof. Wittbrodt. O acesso é feito aqui por uma etiqueta composta por alguns aminoácidos que funciona como um “bilhete de entrada”. Os cientistas agora criaram uma espécie de “bilhete de entrada VIP” geralmente válido, que permite que enzimas equipadas com ele entrem no núcleo muito rapidamente. Eles o chamaram de “tag de alta eficiência”, “hei-tag” para abreviar. “Outras proteínas que precisam penetrar no núcleo da célula também são mais bem-sucedidas com ‘hei-tag'”, conclui o Dr. Thomas Thumberger, que também é pesquisador do Centro de Estudos de Organismos (COS). Em cooperação com farmacologistas da Universidade de Heidelberg, a equipe pôde mostrar que Cas9 em conexão com o bilhete “hei-tag” pode permitir alterações de genoma altamente eficientes e direcionadas não apenas no organismo modelo medaka, o ricefish japonês (Oryzias latipes), mas também em culturas de células de mamíferos e embriões de camundongos.

Em um estudo posterior, os cientistas de Heidelberg mostraram que os editores de base operam de forma altamente eficiente no organismo vivo e são adequados até mesmo para a triagem genética. Em um experimento com peixes de arroz japoneses, eles foram capazes de mostrar que essas modificações direcionadas e limitadas localmente em blocos de construção individuais do DNA alcançam um resultado que, de outra forma, só é obtido pela criação comparativamente trabalhosa de organismos com genes alterados. A equipe de pesquisa do COS, em cooperação com o Dr. Jakob Gierten, cardiologista pediátrico do Heidelberg University Hospital, focou em certas mutações genéticas. Essas mutações eram suspeitas de desencadear defeitos cardíacos congênitos em humanos. Através da modificação de blocos de construção individuais do DNA dos genes relevantes no organismo modelo, os cientistas foram capazes de imitar e estudar embriões de peixes com os defeitos cardíacos descritos. A intervenção direcionada levou a mudanças visíveis no coração já durante os estágios iniciais do desenvolvimento embrionário dos peixes, dizem Bettina Welz e Dr. Alex Cornean, dois dos primeiros autores do estudo da equipe do Prof. Wittbrodt. Isso permitiu aos pesquisadores confirmar a suspeita original e estabelecer uma conexão causal entre a alteração genética e os sintomas clínicos.

A intervenção precisa no genoma dos embriões de peixes foi possível por meio do software especialmente desenvolvido ACEofBASEs, que está disponível online. Ele permite identificar localizações genéticas que levam de forma muito eficiente às mudanças desejadas nos genes-alvo e nas proteínas resultantes. Os cientistas dizem que o ricefish japonês é um excelente organismo modelo genético para modelar mutações como as identificadas nos respectivos pacientes. “Nosso método permite uma análise de triagem eficiente e pode, portanto, oferecer um ponto de partida para o desenvolvimento de tratamento médico individualizado”, de acordo com Jakob Gierten.

Um terceiro estudo, novamente do grupo de Wittbrodt, trata das limitações dos editores de base. Para tal editor ligar o DNA de uma célula-alvo, deve haver um determinado motivo de sequência. É chamado Protospacer Adjacent Motif, PAM para abreviar. “Se esse motivo estiver faltando perto do bloco de construção do DNA a ser alterado, é impossível trocar nucleotídeos”, explica o Dr. Thumberger. Uma equipe sob sua direção encontrou agora uma maneira de contornar essa limitação. Dois editores básicos em uma única célula são usados ​​sucessivamente. Em uma etapa inicial, é gerado um novo motivo de ligação de DNA para outro editor de base, sobre o qual esse segundo editor, que é aplicado simultaneamente, pode editar um site que antes era inacessível. Esse uso escalonado acabou sendo altamente eficiente, explica Kaisa Pakari, primeira autora do estudo. Com esse truque, os cientistas de Heidelberg conseguiram aumentar em 65% o número de possíveis locais de aplicação de editores de base estabelecidos. Agora, sequências de DNA inicialmente inacessíveis também podem ser modificadas.

“Otimizar as ferramentas existentes para edição do genoma e sua aplicação ajustada resulta em possibilidades extremamente variadas para pesquisa básica e, potencialmente, novas abordagens terapêuticas”, sublinha Joachim Wittbrodt.

Os resultados da pesquisa foram publicados nas revistas eLife e Desenvolvimento. As investigações fizeram parte da pesquisa realizada no Cluster de Excelência “3D Matter Made to Order”, administrado em conjunto pela Universidade de Heidelberg e pelo Instituto de Tecnologia de Karlsruhe. Os estudos de pesquisa e os cientistas envolvidos foram financiados pelo Conselho Europeu de Pesquisa, Fundação Alemã de Pesquisa, Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular, Fundação Alemã do Coração e Fundação Joachim Herz.